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mRNAのLC分離

mRNAは、2020年に新型コロナウイルスのワクチンとして承認されたのを機に、様々な感染症ワクチンや癌・遺伝子疾患などの治療薬として急速に研究開発が進んでいます。その特性解析や品質管理、製造における分析・精製の手段の一つとして、HPLCでの分離が期待されます。
ここでは逆相モード、イオン交換モードによるmRNAのLC分離例をご紹介します。

逆相モードにおける分離

mRNAは分子サイズが大きいため、細孔径の大きな充填剤のカラムが適しています。mRNAは負電荷を帯びた高極性分子であり、逆相分離においては保持が弱いため、移動相にはトリエチルアミン (TEA) などの正の解離基を有するイオンペア試薬が用いられます。
下記の（A）のクロマトグラムは、mRNAのモデル化合物として、100–1000 basesのRNAマーカーを分析した例を示します。細孔径30 nmのワイドポアカラムTriart Bio C4を使用し、移動相には酢酸トリエチルアミン (TEAA) 水溶液とアセトニトリルを用いています。種々の条件を最適化することでピーク形状が改善でき、すべてのピークを良好に分離できました。
（B）のクロマトグラムは、RNAマーカーの分離条件を参考に、Accura Triart Bio C18を用いて市販のEGFP mRNA (996 nt) およびCas9 mRNA (4521 nt) を分離した例を示しています。それぞれのmRNAが異なる保持時間に溶出しています。
条件検討やカラム選択については、技術資料をご覧ください。

（A）RNAマーカー (100-1000 bases) の分離

Column YMC-Triart Bio C4 (3 µm, 30 nm)
100 X 2.1 mmI.D.
Eluent A) 50 mM TEAA* (pH 7.0)/
  acetonitrile (95/5)
B) acetonitrile
5-10%B (0-10 min)
Flow rate 0.2 mL/min
Temperature 50°C
Detection UV at 254 nm

*triethylammonium acetate

【分離改善の検討項目】
カラム温度
移動相の緩衝液濃度
移動相pH
グラジエント勾配
カラムハードウェア

Column Accura Triart Bio C4 (3 µm, 30 nm)
100 X 2.1 mmI.D.
Eluent A) 50 mM TEAA (pH 7.0)
B) 50 mM TEAA (pH 7.0)/
  acetonitrile (50/50)
18-22.5%B (0-10 min)
Flow rate 0.2 mL/min
Temperature 80°C
Detection UV at 254 nm


（B）市販mRNAの分離

Column Accura Triart Bio C18 (3 µm, 30 nm)
100 X 2.1 mmI.D.
Eluent A) 50 mM TEAA (pH 7.0)
B) 50 mM TEAA (pH 7.0)/acetonitrile (50/50)
20-25%B (0-20 min)
Flow rate 0.4 mL/min
Temperature  80°C
Detection UV at 254 nm
Injection 1 µL (0.25 mg/mL)
Sample CleanCap® EGFP mRNA (5moU) [996 nt]
CleanCap® Cas9 mRNA (5moU) [4521 nt]
(TriLink Bio Technologies)

イオン交換モードにおける分離

陰イオン交換モードでのmRNA分離において良好なピーク形状を得るには、緩衝液のpHを高くする、あるいは添加剤を加える方法があります。
下図の（A）は移動相に高pHのNaOHを用いています。シャープなピーク形状が得られ、マイナーピークも分離できています。ただし、アルカリによるサンプルの分解を抑えるため、分析温度を15°Cの低温にし、短時間で分析するなどの工夫が必要です。
（B）はTris緩衝液にイオンペア効果のある塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）を添加した例です。pH 8.1、カラム温度30°Cのマイルドな条件で、EGFP mRNAとCas9 mRNAが分離できました。

（A）高pH条件

Column BioPro IEX QF (5 µm)
100 X 4.6 mmI.D.
Eluent A) 10 mM NaOH
B) 10 mM NaOH containing 2 M NaCl
0-100%B (0-9 min), 100%B (9-13 min)
Flow rate 1.0 mL/min
Temperature 15°C
Detection UV at 260 nm
Injection 5 µL (0.025 mg/mL)
Sample CleanCap® EGFP mRNA (5moU) [996 nt]
(TriLink Bio Technologies)

（B）イオンペア試薬添加条件

1. EGFP mRNA
2. Cas9 mRNA

Column BioPro IEX QF (5 µm)
100 X 4.6 mmI.D.
Eluent A) 20 mM Tris-HCl containing 0.5 M TMAC* (pH 8.1)
B) 20 mM Tris-HCl containing 0.5 M TMAC*
  + 2.0 M NaCl (pH 8.1)
25-35%B (0-10 min)
Flow rate 0.5 mL/min
Temperature 30°C
Detection UV at 260 nm
Injection 8 µL (each 0.013 mg/mL)
Sample CleanCap® EGFP mRNA (5moU) [996 nt]
CleanCap® Cas9 mRNA (5moU) [4521 nt]
(TriLink Bio Technologies)

*Tetramethylammonium chloride

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