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逆相カラムにおける核酸分析のポイント

オリゴ核酸を薬効本体とする核酸医薬品は、低分子医薬品や抗体医薬品では難しい細胞内分子を標的にすることが可能です。また、低分子医薬品のように化学合成で製造できるため、抗体医薬品と比較して低コストで製造可能です。これらのことから、核酸医薬品の開発が活発化しています。
現在開発されているほとんどの核酸医薬品は、核酸分解酵素ヌクレアーゼに対する耐性獲得や細胞送達性改善のため、ホスホロチオエート化(S化)などの修飾が施されています。
ここでは、ホスホロチオエート型オリゴ核酸のイオンペア逆相分析についてご紹介します。

イオンペア逆相HPLCにおけるオリゴ核酸分離の基本条件

オリゴ核酸は、トリエチルアミン(TEA)やN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)のように、分子内に正の解離基と疎水性官能基を有するイオンペア試薬を用い、負に解離したオリゴヌクレオチドと電荷として中性のイオンペアを形成させ、逆相充填剤で分離します。
イオンペア試薬の他、移動相のpHを調整するための酸性モディファイアも添加されますが、LC-MS分析の感度向上や分離改善の面でメリットがある、ヘキサフルオロ-2-プロパノール(HFIP)が分析のシーンではよく用いられています。
TEA-HFIPの組み合わせはアセトニトリルと混和性が低いため、有機溶媒にはメタノールが使用されます。
逆相イオンペアHPLCでのオリゴ核酸分析においては、固定相(カラム)、移動相(イオンペア試薬および酸モディファイア濃度・種類)、カラム温度などが分離やピーク形状に大きく影響します。

    [移動相]

  • アルキルアミン(イオンペア試薬)種、濃度
  • 酸モディファイア種、濃度
  • 有機溶媒種

    [カラム]

  • カラム種
  • カラムハードウェア

    [その他]

  • カラム温度
  • グラジエント勾配

移動相イオンペア試薬、酸の濃度による影響

TEA-HFIP移動相を用いた20、21merのホスホロチオエート型(S化)オリゴ核酸分析において、TEAとHFIPの濃度を変えて検討しています。TEA-HFIPの濃度が高濃度なほど分離が良好で、ピークがシャープになっています。

    ホスホロチオエート型RNA(RNA All PS)

  1. 5’-U^C^A^U^C^A^C^A^C^U^G^A^A^U^A^C^C^A^A^U-3’
    (RNA 20mer All PS )
  2. 5’-G^U^C^A^U^C^A^C^A^C^U^G^A^A^U^A^C^C^A^A^U-3’
    (RNA 21mer All PS )
  3. ^=Phosphorothioated
Column YMC-Triart Bio C18 (1.9 µm, 30 nm)
50 X 2.1 mmI.D.
Eluent A) クロマトグラム参照
B) methanol
8-18%B (0-10 min)
Flow rate 0.42 mL/min
Temperature

65°C

Detection UV at 260 nm

カラム温度による影響

20、21merのS化オリゴ核酸の分離について、温度を変えて分析しています。
温度が高くなるにつれてピーク形状がシャープになっていますが、90℃ではピーク形状不良となっています。
オリゴ核酸の配列によって温度依存性は異なるため、適切な温度条件を確認する必要があります。

  1. RNA 20mer All PS
  2. RNA 21mer All PS
Column YMC-Triart Bio C18 (1.9 µm, 30 nm)
50 X 2.1 mmI.D.
Eluent A) 15 mM TEA-400 mM HFIP
B) methanol
Gradient slope 1%B/min (initial %B=クロマトグラム参照)
Flow rate 0.42 mL/min
Temperature

クロマトグラム参照

Detection UV at 260 nm

カラムハードウェアによる影響

オリゴ核酸に含まれるリン酸基は金属材料に吸着し、ピークのブロードニングやキャリーオーバーによる定量性・LC-MS感度低下の原因になります。バイオイナートカラムAccura Triartを使用すると、このような金属への吸着を抑制し、ステンレス製カラムに比べピーク高さが高く、高感度分析が可能です。

  1. RNA 20mer All PS
  2. RNA 21mer All PS
Column 1.9 µm, 30 nm
50 X 2.1 mmI.D.
Eluent A) 15 mM TEA-400 mM HFIP
B) methanol
8-18%B (0-10 min)
Flow rate 0.42 mL/min
Temperature 65°C
Detection UV at 260 nm

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