テクニカルインフォメーション

イオン交換カラムによるオリゴヌクレオチド分析時のポイント

化学合成で製造可能なオリゴヌクレオチドを薬効本体とする核酸医薬品の可能性が再認識され、研究開発が活発化しています。その中で、核酸医薬品合成後の類縁体の分析や分離精製が重要な課題となっています。
ここではノンポーラスタイプのイオン交換カラムYMC-BioPro QA-Fを用いたオリゴヌクレオチドの分析時のポイントを紹介します。

サンプル

一本鎖DNA 5’-TCATCACACTGAATACCAAT-3’ (DNA 20 mer)
5’-GTCATCACACTGAATACCAAT-3’ (DNA 21 mer)
一本鎖RNA 5’-U(M)C(M)A(M)U(M)C(M)A(M)C(M)A(M)C(M)U(M)G(M)A(M)A(M)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-3’
(2’-OMe RNA 20 mer)
5’-G(M)U(M)C(M)A(M)U(M)C(M)A(M)C(M)A(M)C(M)U(M)G(M)A(M)A(M)U(M)A(M)C(M)C(M)A(M)A(M)U(M)-3’
(2’-OMe RNA 21 mer)
5’-UCAUCACACUGAAUACCAAU-3’ (RNA 20 mer)
5’-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-3’ (RNA 21 mer)

N(M)=2’-OMe RNA

キャリーオーバーの改善

グラジエント初期のNaCl濃度が低い場合はキャリーオーバーが認められますが、 グラジエント初期のNaCl濃度を高く(300-400 mM NaClなど)することで、 キャリーオーバーのない再現性の良いクロマトグラムが得られます。

A) 20 mM Tris-HCl (pH8.1)
B) 20 mM Tris-HCl (pH8.1) containing 1.0 M NaCl
5-70%B (0-15 min), 74%B (15-18 min), 5%B (18-33 min)
グラジエント初期:50 mM NaCl

A) 20 mM Tris-HCl (pH8.1)
B) 20 mM Tris-HCl (pH8.1) containing 1.0 M NaCl
40-70%B (0-15 min), 74%B (15-18 min), 40%B (18-33 min)
グラジエント初期:400 mM NaCl

共通条件
Column YMC-BioPro QA-F, 5 µm, 100 X 4.6 mmI.D.
Flow rate 1.0 mL/min
Temperature 25°C
Detection UV at 260 nm
Injection 2 µL (10 nmol/mL)

テイリングの改善

緩衝液は、20 mM Tris-HCl (pH8.1)より10 mM NaOHにて、オリゴヌクレオチドのピーク形状が良好です。また、カウンターイオンとして使用する塩は、NaCl よりNaClO4を用いる方がピークテイリングが抑えられています。
オリゴヌクレオチド分析で良好なピーク形状を得るためには、緩衝液の種類、塩の種類を最適化することが有効です。

1) 緩衝液の種類の影響

Eluent A) X
B) X containing 2.0 M NaCl
15-100%B (0-30 min)

2) 塩の種類の影響

Eluent A) 10 mM NaOH
B) 10 mM NaOH containing 2.0 M Y
15-100%B (0-30 min) for NaCl
5-50%B (0-30 min) for NaClO4

イオン交換において、NaClO4を用いる場合は溶出力が2-3倍大きくなるため、移動相条件のグラジエント比率を調整しています。

共通条件
Column YMC-BioPro QA-F, 5 µm, 100 X 4.6 mmI.D.
Flow rate 1.0 mL/min
Temperature 25°C
Detection UV at 260 nm
Injection 2 µL (10 nmol/mL)
Sample RNA 20 mer

最適化条件での分析

オリゴヌクレオチドの分析について、ノンポーラスタイプのイオン交換カラムであるYMC-BioPro QA-Fを用いて、移動相の緩衝液の種類、塩の種類、グラジエント条件を最適化することにより、キャリーオーバー、テイリングなく溶出する分析条件を見出すことができました。

一本鎖 DNA

一本鎖 2'-OMe RNA

一本鎖 RNA

Column YMC-BioPro QA-F
5 µm, 100 X 4.6 mm.I.D.
Eluent A) 10 mM NaOH
B) 10 mM NaOH containing 1.0 M NaClO4
25-55%B (0-15 min), 100%B (15-20 min)
Flow rate 1.0 mL/min
Temperature 25°C
Detection UV at 260 nm
Injection 4 µL (各5 nmol/mL)