テクニカルインフォメーション

ペプチド・タンパク質の分離

ペプチドやタンパク質を分析する際は目的によって適切な分離モード・カラムを選択します。高分離が必要な場合にはイオン交換や逆相HPLCが用いられます。逆相HPLCでは、分子量15万程度までのタンパク質の分離が可能です。
サイズ排除は分子量によって分離するため、分子量分布などの情報を得ることもできます。

ペプチドマッピングの分離モードによる比較

BSA(MW 66,000)のトリプシン消化物を3種類の分離モードで分離しています。サイズ排除のクロマトグラムから、この試料中には、分子量が100前後から20,000程度のものまで幅広い分子量のフラグメントが存在していることが分かります。一方、イオン交換や逆相は、各成分の構造の違いによる分離能に優れ、非常に多くのピークが検出できています。

イオン交換

BioPro IEX QA 5μm, 50 X 4.6 mmI.D.

Eluent A) 20 mM Tris-HCl (pH 8.6)
B) 20 mM Tris-HCl (pH 8.6) containing 0.5 M NaCl
0-15%B (0-30 min), 15-60%B (30-60 min)
Flow rate 0.5 mL/min
Temperature 25ºC
Detection UV at 220 nm
Injection 20 µL

サイズ排除

YMC-Pack Diol-120+Diol-60 5μm, 500 X 8.0 mmI.D. X 2

タンパク質・ペプチド較正曲線
1. Myoglobin    (MW 17,000)
2. Insulin (Bovine)   (MW 5,700)
3. Neurotensin   (MW 1,672)
4. Tetraglycine   (MW 246)
5. Glycine     (MW 75)


Eluent 0.1 M KH2PO4-K2HPO4 (pH 7.0)
containing 0.2 M NaCl/acetonitrile (70/30)
Flow rate 0.7 mL/min
Temperature ambient (25ºC)
Detection UV at 220 nm
Injection 5 µL

逆相

YMCbasic 5μm, 150 X 2.0 mmI.D.

Eluent A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitril/TFA (100/0.1)
5-35%B (0-50 min), 35-45%B (50-55 min), 45%B (55-60 min)
Flow rate 0.2 mL/min
Temperature 37ºC
Detection UV at 220 nm
Injection 1 µL

ペプチド・タンパク質分離におけるカラム選択ガイド

タンパク質およびペプチドを分離する際、分離対象化合物の分子量を目安にカラムの選定を行います。Triart C18/C8は、高温条件での使用により分子量3万程度までのペプチド・タンパク質の分離が可能です。より大きい分子量のタンパク質では、分子が十分に拡散できるワイドポアのカラムが有効です。細孔径が30 nmのTriart Bio C4は、高温条件との組み合わせでおよそ15万程度まで分析可能です。
高温条件では、移動相の粘度の低下と物質移動速度の改善によりピーク形状が改善されます。高温条件でも耐久性の高いTriartシリーズはペプチド・タンパク質の分析に有効です。
Triart以外にもシリカゲル基材やコアシェル基材の製品もラインナップしているため、化合物や分離条件に合わせて選択できます。