テクニカルインフォメーション

逆相カラムにおけるペプチド・タンパク質の分離のポイント

逆相カラムでペプチド・タンパク質の分離をする際は、カラムの選択がポイントとなります。分離対象物質の分子量に合わせて適切なカラムを選択し、グラジエント勾配や移動相溶媒、カラム温度など分離条件の最適化を行います。

ペプチド・タンパク質分離に影響するファクター

カラム

ターゲットのペプチド・タンパク質の分子量や疎水性に合わせてカラムを選択
一般的に分子量が大きいほど、細孔径が大きく疎水性が低いカラムが適する

移動相

0.1% TFA/acetonitrileのグラジエント溶出がファーストチョイス
 イオン性に差がある混合物の場合、TFAの濃度や酸の種類、pH値の変更も有効
LC/MSではギ酸を含む移動相を多用
分子量の大きいタンパク質では溶出力の高い2-propanolの添加も効果的

温度

分子量が1万以上のタンパク質において、高温分析が非常に効果的
高温条件を使用することで、抗体など15万程度までのタンパク質の分離が可能
 高温条件でも耐久性のあるカラムを選択

ペプチド・タンパク質分離におけるカラム選択ガイド

タンパク質およびペプチドを分離する際、分離対象化合物の分子量を目安にカラムの選定を行います。Triart C18/C8は、高温条件での使用により分子量3万程度までのペプチド・タンパク質の分離が可能です。より大きい分子量のタンパク質では、分子が十分に拡散できるワイドポアのカラムが有効です。細孔径が30 nmのTriart Bio C4は、高温条件との組み合わせでおよそ15万程度まで分析可能です。
高温条件では、移動相の粘度の低下と物質移動速度の改善によりピーク形状が改善されます。高温条件でも耐久性の高いTriartシリーズはペプチド・タンパク質の分析に有効です。Triart以外にもシリカゲル基材やコアシェル基材の製品もラインナップしているため、化合物や分離条件に合わせて選択できます。

ペプチド・タンパク質の分離におけるカラム温度の効果

高温条件では、分離選択性の変化やピーク形状の改善により、分離度が向上しています。高温条件でのピーク形状改善の効果は、タンパク質の分子量が大きいほど顕著となります。
Triartは耐久性に優れているため、高温でも安定した分析が可能です。

  1. Oxytocin      (MW 1,007)
  2. Leu-Enkephalin   (MW 556)
  3. β-Endorphin    (MW 3,465)
  4. Insulin        (MW 5,733)
  5. β-Lactoglobulin A (MW 18,400)
Column YMC-Triart C18 (1.9 µm, 12 nm)
50 X 2.0 mmI.D.
Eluent A) water/TFA (100/0.1)  
B) acetonitrile/TFA (100/0.1)
10-80%B (0-5 min)
Flow rate 0.4 mL/min
Detection UV at 220 nm

カラム(官能基、細孔径)によるペプチド・タンパク質の分離への影響

Triart  C18(5 µm, 12 nm)とTriart Bio C4(5 µm, 30 nm)で分子量1,859から76,000までのペプチド・タンパク質の分離を比較しています。高温条件を用いない場合、分子量が10,000以上になると、C18(12 nm)ではピークがブロードになります(半値幅が増大)が、ワイドポアカラムのC4(30 nm)では高分子量のタンパク質でもピーク形状が良好です。分取など高温条件を使用できない場合、分子量10,000以上のタンパク質の分離には、ワイドポアのC4であるTriart Bio C4が適しています。

Column size 150 X 3.0 mmI.D.
Eluent A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/TFA (100/0.1)
10-95%B (0-15 min)
Flow rate 0.4 mL/min
Temperature 40℃
Detection UV at 220 nm
Injection

4 µL (0.1 ~ 0.5 mg/mL)

Sample γ-Endorphin, Insulin, Lysozyme, β-Lactoglobulin,
α-Chymotoripsinogen A, BSA, Conalbumin

カラム温度・移動相条件による分離への影響

目的化合物の分子量からカラムを選択し、一般的な条件で検討しても分離がうまくいかない場合には、カラム温度や移動相溶媒の種類などを変更することで分離が改善することがあります。 ここでは抗菌ペプチドの分析条件検討例を示します。

分析対象物(抗菌ペプチド)
HPLC共通条件
Column YMC-Triart C18 (1.9 µm, 12 nm) 
50 X 2.0 mmI.D.  
Flow rate 0.4 mL/min
Detection UV at 220 nm

カラム温度における分離比較

一般的なペプチド分析条件で検討すると分離しませんが、温度を70℃に上げて分析すると1, 3のピークと2のピークが分離しています。

Eluent A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/TFA (100/0.1)
25-45%B (0-5 min)  

酸の濃度・種類およびグラジエントの検討

TFAの濃度や酸の種類をギ酸に変更することで分離選択性が変化し、分離が大きく改善しています。さらにアセトニトリルのグラジエント勾配を緩やかにすることで分離度が向上しています。

Eluent A) 酸含有水溶液
B) 酸含有アセトニトリル溶液
(0.1% HCOOHのB液は0.08%)
Temperature 70℃

移動相組成の検討

有機溶媒の組成をacetonitrileから2-propanol/acetonitrile混液に変更し、グラジエント条件を最適化することで、同等の分析時間で分離度が向上しています。ペプチド・タンパク質の分析では、移動相に溶出力の高い2-propanolを添加することで、選択性が変化し分離が改善することがあります。

Eluent A) 0.1% formic acid in water
B) 0.08% formic acid in organic solvent
Temperature 70℃