テクニカルインフォメーション

抗体の分析

抗体の分析には、一般的にイオン交換やサイズ排除クロマトグラフィーが用いられます。イオン交換は電荷の違いにより分離され、高分離が期待できます。一方でサイズ排除は分子サイズによって分離されるため、単量体、二量体、凝集体などの分離に有効です。抗体のフラグメントなど、分子量が10万以下のタンパク質には、高分離が期待できる逆相分離も有効です。

分離モードによる抗体の分離比較

モノクローナル抗体

抗ヒトモノクローナル抗体をイオン交換とサイズ排除で分離しています。サイズ排除(SEC)モードではほぼ単一ピークになっているのに対して、イオン交換モードではアイソフォームに由来すると考えられる複数のピークが認められます。

Mouse monoclonal IgG1 anti-human IgG4 (Purified by DEAE chromatography, containing NaN3)

イオン交換

BioPro IEX QF 5μm, 30 X 4.6 mmI.D.

Eluent A) 20 mM Tris-HCl (pH 8.1)
B) 20 mM Tris-HCl (pH 8.1) containing 0.5 M NaCl
10-25%B (0-18 min)
Flow rate 1.0 mL/min
Temperature 25ºC
Detection UV at 220 nm
Injection 10 µL (0.1 mg/mL)

サイズ排除

YMC-Pack Diol-200 5 μm, 300 X 4.6 mmI.D.

Eluent 0.1 M KH2PO4-K2HPO4 (pH 7.0)
Flow rate 0.17 mL/min
Temperature ambient (25ºC)
Detection UV at 220 nm
Injection 10 µL (0.05 mg/mL)

IgG Fcフラグメント

サイズ排除カラムはIgG全分子とそのフラグメントのように分子量に差があるものの分離に有用です。一方、逆相カラムでは分子量が大きいIgG全分子の分離は困難ですが、Fcフラグメントのような分子量10万以下のフラグメントの分離には有効です

Mouse IgG Fc fragment (Prepared from normal serum)

サイズ排除

YMC-Pack Diol-200 5 μm, 300 X 8.0 mmI.D.

Eluent 0.1 M KH2PO4-K2HPO4 (pH 6.9)
containing 0.2 M NaCl
Flow rate 1.0 mL/min
Temperature ambient (27ºC)
Detection UV at 220 nm
Injection 5 µL (0.5 mg/mL)

逆相

YMC-Pack C4 (30 nm) 5 μm, 150 X 4.6 mmI.D.

Eluent A) water/TFA (100/0.1)
B) acetonitrile/TFA (100/0.1)
25-45%B (0-40 min)
Flow rate 1.0 mL/min
Temperature 37ºC
Detection UV at 220 nm
Injection 5 µL (1.0 mg/mL)