FAQ

YMCには12種類のODSカラムがあります。まず大きく分けるとハイブリッド基材を用いたYMC-Triart C18、シリカ基材を用いたProシリーズ、YMC-Packシリーズ（下記 PolymerC18を除く）、J'sphereシリーズとポリマー基材を用いたYMC-Pack PolymerC18となります。Triart C18はシリカ基材のカラムと比較して耐久性が高く、低圧で使用できるカラムです。シリカ基材を用いたカラムは、バリデーション対応の高性能カラムProシリーズと従来型のYMC-Pack ODSシリーズ、J'sphereシリーズに分かれます。 Proシリーズはエンドキャッピング効率の面でYMC-Pack ODSシリーズ、J'sphereシリーズの上位シリーズに位置付けられます。それぞれのカラムの特長については、カラム紹介のページをご覧下さい。

ODS-AとAMは汎用型ODS、ODS-AQはAやAMよりも炭素含有率が低く、親水性化合物の分離に適した製品です。また、AとAMは基本的物性（基材、炭素含有率、分離特性など）は同じで品質管理基準がAMの方が厳しいという違いがあります。

PolyamineⅡ、PA-Gはポリアミンを化学結合したタイプ、NH2はアミノプロピル基を化学結合したタイプになります。そのため、耐久性の面でPolyamineⅡ、PA-Gの方がNH2より優れています。また選択性にも若干の違いがあります。 PolyamineⅡとPA-Gは、結合しているポリアミンの構造が異なります。PolyamineⅡはPA-Gの上位種に位置付けられ、耐久性が向上しています。

一般的なODS（C18）充填剤はシリカゲルにオクタデシル基が結合したものです。これは、シリカ表面のシラノール基とオクタデシル基の反応によるものですが、オクタデシル基はかさ高く全てのシラノール基と反応させることは不可能です。そのため、オクタデシル基反応後もシラノール基は残っています。これらの残存シラノールは、クロマトグラフィにおいて2次的相互作用を生じさせ、多くの場合、クロマトグラムに悪影響を及ぼします。一般的には塩基性化合物のテーリングやカラムへの不可逆的吸着を引き起します。そこで、これらの残存シラノール基をかさの小さいシリル化 剤で二次シリル化を行います。これをエンドキャッピングといいます。一般的にエンドキャッピングにはトリメチルシラン（TMS）が使用されます。

あります。YMCでは「Hydrosphere C18」、「ODS-AQ」というカラムが水100％移動相で使用可能です。一般的なODSカラムでは水100％移動相を使用した場合、保持時間が短くなる現象が起こり ます。これは疎水性の大きな充填剤表面と水がなじみ難く、充填剤の細孔から水が抜け出すため起こると考えられます。 一方、「Hydrosphere C18」、「ODS-AQ」はC18官能基の導入率を下げることによって、充填剤表面 の親水性が大きく移動相との溶媒和を実現しているため保持時間の減少がほとんど起こりません。

カラム圧力の上限は、長さ150mm以下が20MPa程度、250mmが25MPa程度を目安としてください。ただし、内径が10mm以上のカラムは10MPa程度を上限の目安としてください。

使用可能pH範囲はProシリーズODSでpH 2-8、それ以外のODS、C8、C4等の逆相系カラム、SIL、Polyamine Ⅱ等の順相系カラムではpH 2.0-7.5になります。また、以下のカラムのように広いpH範囲で使用できるカラムもあります。
YMC-Triart C18　pH1-12
YMC-Pack Pro C18 RS　pH1-10
J'sphere　ODS-H80　pH1-9
YMC-Pack PolymerC18　pH2-13。
使用可能な温度の上限は50ºCを目安としてください。推奨使用温度は20-40ºCです。上述した使用条件に当てはまらないものもありますので、ご使用の際は使用説明書をご覧になり確認するようにしてください。

長期間カラムを使用されない場合には、カラムに添付の検査成績書に記載されている出荷時封入溶媒に置換し、あまり高温にならない所に保管してください。また、短期間であっても塩や酸を含む移動相での保管は出来るだけ避けるようにしてください。カラム内の溶媒が揮発しないように、密栓をしっかり閉めるようにしてください。

カラムの性能をチェックするには、購入時に添付されていた検査成績書と同じ条件で検査をして下さい。保持時間、理論段数、ピーク形状等に異常がなければカラム性能に変化がなく、使用可能といえます。ただし、購入後数年経過したカラムではこの性能チェックで異常が見られなくても、イオン性化合物等では分離特性が変化している可能性があります。新しい分析メソッド開発の目的には使用しないでください。新しく購入したカラムで再現性が得られない場合があります。

Proシリーズではアセトニトリル/水（60/40）です。また、YMC-Pack ODS-A、AM、AQ等ではメタノール/水（70/30）、J'sphereシリーズではアセトニトリル100%です。使用説明書に記載されていますので確認してください。

1. 高疎水性の吸着物除去のための洗浄一般的に使用している条件よりも溶出力の強い溶媒で洗浄します。例えば逆相系の場合、有機溶媒の比率を上げた溶離液で洗浄します。カラム容積の10倍量程度を目安に通液して下さい。
2. 充填剤表面状態復元のための洗浄（ピーク形状や保持時間に異常が認められるとき）シリカ系充填剤の場合、残存シラノール基の解離・非解離の状態によって分離挙動に影響を与える場合があります。これを復元するのに酸洗浄が有効な場合があります。0.1%リン酸水溶液/有機溶媒の混液（有機溶媒の比率は10～60%程度）で洗浄することによって、シラノール基を非解離の状態に戻すことが出来ます。

夾雑物の多いサンプルを分析される場合は、ガードカラムの使用が有効です。メインカラムの寿命を延ばすことが出来ます。ガードカラムはメインカラムと同じ充填剤のものを使用されることを推奨します。異なるガードカラムを使用するとピーク形状不良や再現が得られないといった問題が生じることがあります。ガードカラムには、通常のタイプの他にカートリッジタイプのものがあります。頻繁にガードカラムを交換される場合にはカートリッジタイプをお奨めします。また、ガードカラムはメインカラムの内径と同じか、やや小さいものを選択してください。

”接続（W）”はウォーターズタイプの接続を意味しています。現在市販されているカラムのほとんどはこのタイプの接続です。ウォーターズタイプ以外では、島津タイプや日本分光タイプ、日立タイプといった種類があります。これらの違いはフェラルの先端から出ている配管部分の長さです。フェラル一体型のピーク製のオシネを使用している場合には問題になりませんが、ステンレス製の配管、オシネを使用されている場合は、配管とカラムのフィッティングがうまくいかず、液漏れ、ピーク形状不良を起こしたりします。ご使用のシステムがウォーターズタイプ以外の場合、接続変換アダプタを用いるか、フェラルを付け直す処置が必要です。

セミミクロカラム（ここでは内径1.0～2.0mm I.D.のものをセミミクロカラムと呼びます)を使用する際の流速は一般的に50～200μL/min程度で使用されます。カラム長が短くバックプレッシャーが低い場合には、さらに流速をあげることも可能です。システムは通常のHPLCを使用することも可能ですが、試料拡散による理論段数の低下を防ぐために、ポンプ、検出器のフローセル、配管をセミミクロ対応のものにすることが望まれます。

分取をするためカラムのスケールアップをする場合、次のような流れで行います。

ステップ1

分離条件を分析カラムを用いて検討します。

ステップ2

分取スケールを検討します。分取したい量によってカラム径や充填剤粒子径を設定します。

ステップ3

選択した充填剤を詰めた内径4.6mmや6.0mmなどの分析カラムを用いて分取条件の最適化を行います。ステップ１で用いた分析カラムと同じ充填剤粒子径の場合には省略できます。分取スケールが内径100mm以上の場合、続いて20mm内径のカラムで負荷量の確認とランニング コストの算出を行います。

ステップ4

分取の実施

1. フリットの目詰まりの場合

   カラム洗浄方法「1.高疎水性の吸着物除去のための洗浄」に従い、逆フローで洗浄してください。このとき、カラム圧が高くなりすぎないように必要に応じて流速を下げて通液して下さい。

2. 充填剤への吸着物による場合

   カラム洗浄方法「1.高疎水性の吸着物除去のための洗浄」に従い、洗浄してください。1、2いずれの場合も圧力上昇がたびたび起こる場合は、試料の前処理やガードカラムの装着など圧力上昇の防止策をとってください。

1. 移動相条件が不適切

   サンプルがイオン性の化合物の場合、サンプルのpKaと移動相のpHが近いとピーク形状不良を起こします。移動相pHをpKaから離れた値に設定してください。

2. サンプル溶解溶媒の影響

   サンプル溶解溶媒が移動相と異なると、ピーク形状不良が起こる場合があります。その場合は、サンプル溶液を移動相で希釈するか注入量を少量にするといった処置をして下さい。

3. サンプル注入量の過負荷

   サンプル注入量が過負荷の場合にもピーク形状不良が起こります。サンプル注入量を減らしてください。

4. 平衡化不足

   前回の分析がpH調整をした条件で、今回の移動相とpH差が大きいときや、移動相の塩濃度が低いときなどは、カラムの平衡化に時間がかかる場合があります。

5. カラムの汚れ、劣化

   カラムの汚れが原因の場合、「1.高疎水性の吸着物除去のための洗浄」に従い洗浄してください。劣化の場合は回復は不可能です。新しいカラムを購入してください。

6. システムの問題

   セミミクロカラム使用時など、低流速で使用している場合、InjectorからカラムIN側の配管や検出器セル内で拡散が生じ、ピークテイリングの原因となります。システムをセミミクロ対応のものにすることが望まれます。

1. インジェクタの汚れ

   サンプルを注入せず移動相のみをインジェクションしてみてください。ゴーストピークが発生する場合、インジェクタを洗浄してください。

2. グラジエント分析時

   カラムに吸着した不純物が溶出力の強い溶媒組成になったとき、ゴーストピークとして検出されることがあります。カラムの洗浄方法「1.高疎水性の吸着物除去のための洗浄」に従い洗浄してください。それでも改善されない場合は、溶媒の不純物が検出されている可能性があります。使用溶媒のグレードを上げたり、ミキサー前にガードカラムを付け不純物をトラップするといった処置をして下さい。

まず、通常の分析時より低い圧力（1/2以下）で溶媒（シリカ以外：MeOH、シリカ：ヘキサン）を流し、エアを抜いてください。エアが抜けきったことを確認したら、カラムに添付されている検査成績書の条件をトレースして性能チェックをしてください。

1. 移動相条件が不適切

   ■イオン性化合物の分析で、移動相のpHコントロールをしない、または移動相の塩（酸）濃度が低い場合、再現性が得られ難いことがあります。この場合は塩濃度を高めてください。

   ■移動相のpHがサンプルのpKa付近に設定されていると、移動相調整時の微妙なpHのずれで保持時間が大きく変動してしまいます。サンプルのpKaから離れた値に移動相のpHを設定して下さい。

2. システムの差異

   システムが異なると、クロマトグラムの再現が取れない場合があります。ポンプや検出器、インジェクタ等のメーカーが異なるとデッドボリュームが異なり、システム間でピーク形状の再現が取れない場合があります。また、カラム恒温槽のメーカーが異なる場合、同じ温度設定であってもカラムにかかる温度が異なり、保持時間などに影響することがあります。一連の分析は同一システムで分析されることをお奨めします。

3. カラムの使用履歴

   同じ種類のカラムでも、使用履歴が異なるとクロマトグラムの再現が取れない場合があります。例えばイオンペア試薬を含む移動相条件でカラムを使用していたり、疎水性の高い試料が吸着したりして充填剤の表面状態が変わってしまい、再現の取れないケースがあります。同一分析は同じカラムを使用されることを推奨します。

4. 水100％移動相の使用

   一般的なODSカラムの場合、水100％移動相を使用すると保持時間が短くなる現象が起こり、クロマトグラムの再現が得られません。この様な場合、現在各社より水100％移動相使用可能なカラムが販売されていますので、それらを使用されることを推奨します。YMCでは「Hydrosphere　C18」、「ODS-AQ」というカラムが水100％移動相で使用可能です。

5. 移動相のグレードの違い

   移動相に用いる溶媒のグレードが異なると、クロマトグラムの再現が得られない場合があります。低グレードの溶媒に含まれている不純物が塩の働きをすることによって、クロマトグラムに影響を与える場合があります。使用する溶媒はHPLC用をお奨めします。

イオンペア試薬の濃度が高すぎることが原因です。一般にイオンペア試薬の濃度が高いほど保持は大きくなりますが、イオンペア試薬の濃度が一定以上になるとミセルを形成するため、逆に保持が短くなることがあります。イオンペア試薬の濃度は分析スケールで通常5mM～20mM程度で使用しますが、濃度が高くなるほど充填剤の劣化が早くなるので出来るだけ低濃度に設定してください。